La toxina adenilato ciclasa – hemolisina de Bordetella pertussis: Función en la patogénesis y aplicaciones

The adenylate cyclase hemolysin toxin (ACT) is one of the main virulence factors in Bordetella pertussis. It was discovered in 1973 by Wolff and Cook as a contaminant in vaccine formulations against this microorganism. It belongs to the family of toxins that form pores at the plasma membrane of target cells and reaches the highest expression during the virulent phase of the bacteria. This toxin has 1706 aminoacid residues and is composed of two domains: the N-terminal domain, with calmodulin-sensitive adenylate cyclase activity and the Cterminal domain that promotes the formation of pores at the membrane of target cells. Furthermore, the integrins type αMβ2 molecules are natural receptors for the toxin, which binds to the N-glycosylated extracellular portion. ACT allows the bacteria to inhibit phagocytosis, activation of type 1 T-helper cells and cytotoxic T cells as well as gamma interferon production by macrophages. Despite of its toxic effects, the inactivated form of the toxin has been used in delivering immunogenic epitopes to antigen-presenting cells, in the identification of proteins secreted by the type III secretion system and in protein-protein interactions studies. INTRODUCCIÓN La tosferina es una enfermedad aguda que afecta al hombre es provocada fundamentalmente por la bacteria gramnegativa Bordetella pertussis y en menor medida, por Bordetella parapertussis. Se plantea que la enfermedad se transmite a través de aerosoles producidos al toser por el individuo enfermo hacia el sano. En niños menores de un año, la enfermedad tiende a ser fatal, la tos paroxística característica bloquea las vías respiratorias, lo que provoca la asfixia y la muerte. Otros eventos adversos o complicaciones serias de la enfermedad se observan, entre ellos, neumonías bacterianas secundarias, epilepsias, encefalopatía, apnea e hipertensión pulmonar. La infección por B. Yunier Serrano-Rivero y Rafael Fando-Calzada Dpto. Biología Molecular, Dirección Enfermedades Infecciosas, Centro Nacional Investigaciones Científicas. Apartado Postal. 6412 La Habana, Cuba Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 44, No.3, pp. 46-56, 2013. 47 pertussis constituye un problema de salud pública, incluso en países desarrollados con buenas coberturas de vacunación. La evidencia actual confirma que esta enfermedad continúa causando muertes en lactantes con esquemas de vacunación incompletos. Varios países reportaron un incremento en los casos de infección por B. pertussis durante la década pasada, asociada con cambios en la frecuencia reportada por grupos de edad. Se ha identificado un mayor porcentaje de esta enfermedad en adolescentes y adultos. Para llevar a cabo el proceso infeccioso, este microorganismo se adhiere a las células ciliadas del epitelio nasofaríngeo y del árbol traqueo-bronquial mediante moléculas de adhesión: hemaglutinina filamentosa (HFA), fimbrias, pertactina y otras proteínas de superficie. Estas, junto a la toxina pertúsica (TP), la citotoxina traqueal (CTT), la toxina dermonecrótica (TDN) y la toxina adenilato ciclasa-hemolisina (TAC) son sus principales determinantes de patogenicidad. La toxina adenilato ciclasa–hemolisina es también conocida como TAC, CyaA o AC-Hly. Fue primeramente descubierta en 1973 por Wolff y Cook como un contaminante en formulaciones vacunales de células completas contra B. pertussis. Tres años después, Hewlett y Wolff aislaron a partir del sobrenadante de cultivo de este microorganismo una proteína de aproximadamente 70 kDa que carecía de actividad catalítica. En 1985, el grupo de Ladant purificó a partir de cultivo líquido tres proteínas de 70, 50, y 45 kDa, estructuralmente relacionadas y que eran reconocidas por el mismo anticuerpo. Estas, al escindirse proteolíticamente daban origen al fragmento de 43 kDa, lo cual indicó que estos fragmentos procedían de una proteína común de mayor peso molecular, que luego de ser secretada al medio de cultivo era procesada por proteasas. Sin embargo, ninguna de ellas tenía la capacidad de producir adenosinmonofosfato-3',5'-cíclico (cAMP). Luego, Hanski y Fardel corroboraron este hecho aislando proteínas de 190 a 200 kDa con actividad catalítica a partir de extractos crudos de B. pertussis y que además, eran reconocidas por el anticuerpo que había reconocido las proteínas purificadas por el grupo de Ladant en 1985. TAC es una proteína bifuncional con un dominio N-terminal que presenta actividad adenilato ciclasa y un dominio Cterminal, que media la liberación del dominio catalítico dentro del citoplasma en células eucariotas y posee baja, pero detectable actividad hemolítica para glóbulos rojos. Esta toxina permanece asociada a la superficie celular, mientras que solo una pequeña parte es liberada al medio de cultivo. Según investigaciones realizadas por diversos autores, se ha demostrado que la hemaglutinina filamentosa la mantiene anclada a la superficie de la célula bacteriana. La actividad catalítica de la toxina aumenta hasta 1000 veces cuando interactúa con la calmodulina (CaM) que se encuentra en el citoplasma de las células eucariotas. Dicha característica la ubica en el grupo de las adenilato ciclasa de clase II. CyaA también es miembro de la familia de las citotoxinas RTX (del inglés Repeat in Toxin), las cuales promueven la formación de poros en la membrana de las células diana y por lo tanto, producen su lisis. Esta familia de toxinas tiene la característica común de presentar secuencias repetidas en tándem de un nonapéptido rico en los aminoácidos glicina y aspartato, que se localizan cercanas al extremo C-terminal, se unen a la porción glicosilada del extremo N-terminal de los receptores αMβ2 y son secretadas por un sistema de secreción tipo I. El objetivo de este trabajo consistió en brindar una información lo más actualizada posible acerca de la toxina adenilato ciclasa-hemolisina de Bordetella pertussis, su estructura, el papel que desempeña en la patogénesis de la enfermedad, así como sus diferentes aplicaciones en la industria biofarmacéutica y en la investigación básica. REGULACIÓN DE LA VIRULENCIA EN Bordetella pertussis Bordetella pertussis posee un número importante de factores de virulencia. La expresión de la mayoría de estos factores está regulada o modulada en respuesta a cambios en las condiciones ambientales a través de un sistema de transducción de señales de dos componentes sensor/activador denominado BvgAS (Bordetella virulence gene activador / sensor, en el idioma inglés). Entre los factores de virulencia cuya expresión es controlada por este sistema se encuentran: adhesinas, autotransportadores y toxinas, entre las toxinas se encuentra la adenilato ciclasa-hemolisina. Asimismo, B. pertussis presenta algunos factores cuya expresión es independiente de dicho sistema de regulación. El sistema BvgAS está compuesto por un regulador transcripcional, BvgA de 23 kDa y un sensor híbrido anclado a la membrana externa, BvgS de 135 kDa. La activación del BvgAS implica un mecanismo de fosfotransferencia de cuatro pasos (Fig. 1 a). In vitro, el sistema se activa cuando la bacteria crece a 37 oC en un medio de cultivo estándar y se inactiva a temperaturas de incubación inferiores a 26 oC o en presencia de concentraciones milimolares de agentes moduladores como MgSO4 (≥ 40 mmol/L) o ácido nicotínico (≥ 10 mmol/L). El sistema BvgAS funciona controlando la expresión diferencial de distintos genes asociados con la virulencia a lo largo de tres fases fenotípicas: i) La fase virulenta o Bvg+, caracterizada por la expresión de los genes vag (virulence activated genes), los cuales codifican factores de virulencia. Estos genes se pueden diferenciar de acuerdo con su expresión temporal en vag tempranos (codifican algunas adhesinas) y vag tardíos (codifican toxinas). Asimismo, esta fase se identifica por la ausencia de expresión de los genes vrg (virulence repressed genes), de función aún no esclarecida. ii) La fase avirulenta o Bvg se identifica por la ausencia de expresión de los genes vag y la expresión de los genes vrg. iii) La fase intermedia o Bvg (etapa de transición entre las fases Bvg+ y Bvg) se caracteriza por la expresión de los genes vag tempranos, el gen bvgAS y el gen bipA, único gen de su clase identificado hasta ahora (Fig. 1 b). De este modo, Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 44, No.3, pp. 46-56, 2013. 48 el sistema BvgAS funcionaría como un “reóstato”, controlando de manera ajustada y coordinada la expresión diferencial de varios perfiles de genes relacionados con la virulencia en al menos tres fases fenotípicas. Fig .1. a) Esquema del sistema de dos componentes BvgAS y de su mecanismo de activación. BvgS es una proteína sensora transmembrana integrada por: dominio periplásmico (P), región de unión (L), dominio con actividad histidina quinasa (HPK), dominio receptor (R) y dominio con actividad histidina fosfotransferasa (HPT). La proteína BvgA es un regulador de respuesta que contiene un dominio receptor (R) y un dominio hélice-giro-hélice (HTH) que permite la unión a ADN. In vitro, la proteína BvgS recibe la señal (paso 1), se autofosforila (paso 2) e inicia la fosfotransferencia que conduce a la activación de BvgA (pasos 3, 4 y 5). El sistema BvgAS controla cuatro clases de genes asociados con la virulencia, y que se expresan de modo diferencial definiendo tres fases fenotípicas: Bvg+, Bvgi y Bvg-. b) Curvas de expresión relativa de las cuatro clases de genes. La fase Bvg+ se caracteriza por la expresión de los vag tardíos como cyaA que codifica la toxina AC (curva 1) y de los genes vag tempranos como fhaB que codifica la adhesina FHA (curva 2). La fase Bvgi se identifica por la expresión de los genes vag tempranos y de los que se expresan en la transición entre Bvg+ y Bvg-, como bipA (curva 3). La fase Bvgse define por la expresión de los genes vrg (curva 4), con modificaciones. Existen evidencias que sugieren que durante la transmisión de persona a persona hay factores ambientales que determinarían que B. pertussis se encuentre en fase Bvg o Bvg. De esta manera, durante los primeros estadios de colonización este patógeno no expresaría las proteínas codificadas por los genes vag (bacteria en fase Bvg). Posteriormente, la expresión de adhesinas (fase Bvg) inducidas por un cambio en las condiciones del entorno, favorecería la interacción con las células del epitelio respiratorio. Luego de esta etapa, la expresión de toxinas propias de la fase Bvg generaría la alteración de los mecanismos de defensa del hospedero. ESTRUCTURA DE LA ADENILATO CICLASA-HEMOLISINA La toxina adenilato ciclasa hemolisina presenta un peso molecular de 200 kDa, y es secretada como una cadena polipeptídica de 1706 aminoácidos (aa), que presenta dos dominios; uno con actividad adenilato ciclasa (AC), que se localiza dentro de los 400 aminoácidos próximos al extremo N-terminal y el dominio RTX ó hemolítico Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 44, No.3, pp. 46-56, 2013. 49 (Hly) que involucra los 1306 aminoácidos restantes y promueve la formación de poros en la membrana. El dominio con actividad catalítica presenta estructuras secundarias en α-hélice y hojas β, y está compuesto por dos subdominios conocidos como T25 y T18, en el primero se localiza el sitio catalítico, mientras que en el segundo se haya el sitio principal de unión a CaM. Ambos subdominios pueden ser obtenidos in vitro mediante proteólisis limitada y son capaces de reasociarse con CaM para formar una estructura terciaria catalíticamente activa. A su vez, este dominio puede ser dividido en tres regiones RC1, RC2 y RC3 respectivamente. Estas regiones son altamente conservadas y estructuralmente idénticas. En ausencia de CaM, el dominio AC se encuentra desordenado, su estructura terciaria es compacta e hidratada. Cuando el extremo C-terminal de la CaM interactúa con el subdominio T18 de la toxina, el dominio catalítico adopta una conformación extendida y deshidratada, sin cambios significativos en la estructura, pero sí en sus propiedades hidrodinámicas. Por otro lado, el dominio RTX de TAC, básicamente puede ser dividido en cuatro regiones: (1) la región en la que se ubican varios segmentos hidrofóbicos que se insertan en la membrana plasmática y adoptan estructuras en α-hélice, (2) la región en la que ocurre la palmitoilación de la Lys 860 y la Lys , (3) la región en la que hay de 38 a 42 repeticiones de los motivos RTX, y finalmente, (4) una señal de secreción carboxi-terminal no procesada. Los motivos RTX son secuencias formadas por el nonapéptido GGXGXDXUX, donde X puede ser cualquier aminoácido y U es ocasionalmente sustituido por V, I, F, ó Y. En presencia de calcio, el dominio C-terminal sufre un cambio conformacional, de modo que varios motivos adyacentes se pliegan, formando una hélice β. Todos los motivos RTX están constituidos por un giro β que involucra a los primeros seis aminoácidos de cada nonapéptido (GGXGXD) y una pequeña hoja β, formada por los aminoácidos (XUX) restantes. El calcio se une al grupo carbonilo de la cadena lateral del aspartato, presente en cada giro β. En la molécula TAC, los motivos RTX se encuentran organizados en cinco bloques (A-E), cada uno con 8-10 motivos RTX separados por regiones de enlace de longitud variable (23-49 residuos). La unión de 30 a 40 iones calcio es de vital importancia para el plegamiento y actividad de la toxina (Fig. 2.). Fig .2. Organización estructural de la toxina Adenilato ciclasa de Bordetella pertussis (CyaA). Los números representan los residuos de aminoácidos. El dominio catalítico (AC) se amplía para mostrar los subdominios T25 y T18. SUC se corresponde con el principal sitio de unión a calmodulina, RC1, RC2 y RC3 representan regiones que participan en la catálisis. A, B, C, D y E son los bloques que agrupan los motivos RTX, con modificaciones. Para la mayoría de las toxinas RTX, la función de los motivos RTX no se encuentra definida; sin embargo, se cree que estén involucrados en el proceso de secreción, debido a que la mayoría de los factores de virulencia que presentan dichos motivos son secretados por un sistema de secreción tipo I. Este dominio no se encuentra plegado durante la secreción de la toxina, lo que es de vital importancia para el proceso. EL OPERÓN cyaABDE El operón cyaABDE esta compuesto por cuatro genes: el gen estructural cyaA y tres genes, cyaB, D y E, necesarios para la secreción de la toxina CyaA. Estos genes codifican para proteínas de 712 aa, 440 aa y 474 aa, respectivamente y se localizan a continuación del gen estructural. El gen cyaC no forma parte del operón y se transcribe en sentido inverso al mismo (Fig. 3). El producto del gen cyaC es una proteína de aproximadamente 21 kDa encargada de la activación de CyaA y actúa palmitoilando la Lys 860 y la Lys. 983 Fig .3. Organización de los genes en el operón cyaABDE. Las flechas son los genes e indican el sentido de la trascripción. Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 44, No.3, pp. 46-56, 2013. 50 La palmitoilación de estos residuos es crucial para la actividad adenilato ciclasa y formadora de poros de la toxina. Investigaciones realizadas por Laoide y Ullmann demostraron que la transcripción del gen cyaA está regulada por un promotor que se encuentra 115 pares de bases antes del sitio de inicio de la transcripción, la cual es activa solamente en cepas virulentas de B. pertussis y la terminación de la misma ocurre inmediatamente después del extremo 3 ́. Sin embargo, se han detectado transcriptos de gran longitud que corresponden a la trascripción total del operón cyaABDE, lo cual indica que la maquinaria de trascripción no siempre reconoce el terminador de la trascripción entre el gen estructural y los genes que intervienen en la secreción de CyaB. En este operón también fue identificado un segundo sitio de inicio de la trascripción en la región intergénica cyaA-cyaB que se localiza 30 pb antes del gen cyaB. La transcripción de los genes involucrados en la secreción de la toxina ocurre de manera constitutiva, tanto en cepas virulentas como en las no virulentas. De esta manera, la expresión de la virulencia asociada a la toxina se encuentra controlada positivamente a través de una proteína que actúa en trans, codificada por el locus bvg, mientras que los genes de transporte muestran un bajo nivel de expresión constitutiva, independiente del control de la virulencia. Por otra parte, CyaA, no contiene un sitio de alta afinidad para la proteína BvgA en su promotor; de modo que en su lugar tiene varios heptámeros de la secuencia consenso 5 -TTTCCTA3 ́ que se extiende desde los nucleótidos -137 y -51, a partir del sitio de inicio de la trascripción. La fosforilación de BvgA es absolutamente requerida para la unión a dichos sitios. La principal secuencia para la unión de BvgA~P se localiza entre los nucleótidos -100 y -80 y la unión a estos desencadena interacciones cooperativas de BvgA~P con los sitios vecinos de baja afinidad. RECEPTORES αMβ2: GENERALIDADES Los receptores αMβ2 pertenecen a la subfamilia de los receptores leucocitarios, conocidos también como: receptores del complemento3 (CR3, CD11b/CD18, ó Mac-1.) Esta subfamilia de receptores integra la matriz extracelular con el citoesqueleto mediante la transmisión bidireccioinal de señales. Estas moléculas constituyen un subgrupo de glicoproteínas heterodiméricas y transmembránicas que juegan un papel importante en diferentes funciones celulares como: la adhesión de leucocitos al endotelio, la agregación y quimiotaxis de neutrófilos y monocitos, así como la fagocitosis y lisis de eritrocitos. Todas estas funciones son mediadas por la interacción de la integrina con, al menos, uno de sus ligandos, los cuales incluyen moléculas de adhesión intercelular-1,2 (ICAM1,2), factores inactivos del complemento (iC3b), factor X y fibrinógeno.Adicionalmente, también son activados por otros componentes procedentes de microorganismos, tales como lipopolisacáridos y proteínas. La subfamilia de receptores-especifico de leucocitos consta de cuatro miembros: αXβ2, αLβ2, αDβ2 y αMβ2, respectivamente. Todos presentan una estructura modular formada por tres regiones: (i) una región extracelular larga y glicosilada en la que se encuentra el sitio de unión al ligando, (ii) un segmento transmembránico y (iii) una corta región citoplasmática, que requiere del concurso de proteínas adaptadoras para interactuar con el citoesqueleto. Las cadenas α y β de los receptores αMβ2 corresponden a glicoproteínas transmembrana de 165 kDa y 95 kDa, y están frecuentemente expresados en la superficie de linfocitos, células NK, monocitos, macrófagos y granulocitos. MECANISMO DE ENTRADA DE TAC EN LAS CELULAS DIANA El dominio catalítico (AC) de la toxina es conducido hacia el citoplasma de la célula diana a través del poro formado por el dominio RTX. Este proceso se conoce como internalización ó intoxicación. Varias evidencias apoyan el mecanismo de liberación del dominio catalítico: Primero, la aparición de la intoxicación es rápida; un incremento de los niveles de AMPc puede ser detectado dentro de segundos después de adicionada la toxina. Segundo, su entrada es independiente de la acidificación de las vesículas endocíticas. Finalmente, y más importante TAC es capaz de invadir tipos celulares que no presentan receptores αMβ2, tal como es el caso de los eritrocitos. El mecanismo exacto por el cual la toxina es internalizada en la célula diana no se conoce con claridad. De manera general, en este proceso se pueden distinguir dos etapas. En la primera etapa, TAC se une a la superficie celular, posiblemente a gangliósidos. Esto requiere la integridad del extremo C-terminal de la toxina y de la palmitoilación de la Lys. La unión de la toxina a los eritrocitos eventualmente conduce a su lisis, debido a la capacidad que presenta de formar poros en la membrana. El segundo paso consiste en la liberación del dominio catalítico dentro del citoplasma de la célula diana, a través del poro formado en la membrana plasmática por el dominio C-terminal (Fig. 4). Este proceso es dependiente de la temperatura, del potencial de membrana y de la presencia de concentraciones milimolares de iones calcio. EFECTOS DE LA TOXINA ADENILATO CICLASA – HEMOLISINA EN LAS FUNCIONES CELULARES La función celular es afectada primeramente por la actividad adenilato ciclasa de la toxina. En macrófagos, es suficiente con una de sus dos actividades. La actividad adenilato ciclasa y la formadora de poros pueden actuar sinergísticamente potenciando sus efectos en las células diana. Una de las consecuencias de estas actividades que contribuyen a los efectos citotóxicos de la toxina; es el agotamiento de ATP por la actividad AC y la entrada de calcio por la formación de poros en la membrana. Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 44, No.3, pp. 46-56, 2013. 51 Fig .4. Mecanismo hipotético de liberación del dominio catalítico de la toxina adenilato ciclasa – hemolisina de Bordetella pertussis (TAC) a través de la membrana plasmática de la célula diana. Las flechas negras son las hojas β y las líneas continuas que unen a cada hoja son los giros β. (a) A bajas concentraciones de calcio (<0,1mmol/L), los dominios hidrofóbicos (cilindros) y las cadenas de ácido palmítico, son primeramente insertados en la membrana. (b) Con altas concentraciones de iones calcio ( >0,1mmol/L) (círculos grises) se unen a los motivos RTX, lo cual induce un cambio conformacional en estos motivos que resulta en la liberación del dominio catalítico (AC) en el citoplasma. Luego de la unión de la calmodulina (CaM), AC cataliza la síntesis de AMPc a partir de ATP: Membrana externa (ME) y membrana interna (MI). TAC provoca cambios en la morfología celular, incluyendo formación de vesículas en la membrana y en el tamaño de los eritrocitos a través de su actividad hemolítica. Este hecho se correlaciona con la acumulación de esta molécula en subdominios de la membrana. En macrófagos, la actividad AC provoca la inactivación de la GTPasa-RhoA, dando lugar a reordenamientos en el citoesqueleto y la inhibición de la fagocitosis, mediada por el complemento. Adicionalmente, la acumulación de AMPc induce apoptosis en diferentes células y puede potenciar los efectos apoptóticos de drogas anticancer en diferentes líneas de células cancerosas. EFECTOS DE LA TOXINA ADENILATO CICLASA – HEMOLISINA EN LA MODULACION DE LA RESPUESTA INMUNE TAC modula la respuesta del sistema inmunológico inhibiendo la fagocitosis y los mecanismos oxidativos en neutrófilos humanos. Estudios en modelos animales demostraron que esta toxina es uno de los más importantes factores de virulencia de B. pertussis. Esta toxina puede inducir apoptosis en macrófagos in vitro e in vivo. Se ha observado que las cepas mutantes de B. pertussis que no expresan esta toxina son eficientemente fagocitadas por neutrofilos humanos. Por otra parte, la toxina adenilato ciclasa también tiene un importante efecto inmunomodulador en el hospedero, lo que contribuye a la patogénesis y sus efectos parecen ser una mezcla de actividades estimuladoras e inhibitorias. TAC también regula la expresión de las moléculas MHC clase II y coestimulatorias en las células dendríticas, induciendo en éstas un estado semimaduro y como consecuencia disminuye la producción de citoquinas proinflamatorias. Este efecto es consecuencia de la actividad enzimática de la toxina, cuya función citotóxica en células eucariota está asociada a su capacidad formadora de poros. Otros estudios sugieren que la actividad adenilato ciclasa induce la producción de la citoquina IL-23 e inhibe la de IL-12, esta última es esencial en la activación de las células T colaboradoras de tipo1(Th1), de las células T citotóxicas, células NK, y en la producción de interferón-γ por macrófagos. Adicionalmente, la actividad enzimática de la toxina también promueve la producción de IL-10 en células dendríticas e impide la activación y quimiotaxis de los linfocitos T. Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 44, No.3, pp. 46-56, 2013. 52 APLICACIONES DE LA TOXINA ADENILATO CICLASAHEMOLISINA Uso como herramienta de entrega de antígenos A partir del hecho de que TAC es capaz de entregar epítopes a las células presentadoras de antígeno e introducir su sitio catalítico directamente en el citoplasma de las mismas, diversas versiones de la toxina inactivadas enzimáticamente han sido utilizadas como vector para la internalización de epítopes inmunogénicos, que luego son procesados y presentados por moléculas MHC clase I y II. Estos epítopes estimulan la respuesta de los linfocitos T CD4 y T CD8, confiriendo protección contra infecciones o tumores. Los epítopes inmunogénicos pueden ser fusionados al dominio catalítico de TAC de dos maneras; ya sea por métodos químico ó mediante ingeniería genética, siendo este último el más empleado. En modelos animales, se estudió el efecto de la fusión de epítopes procedentes del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) al dominio catalítico de TAC, y como resultado de este experimento se indujo respuesta de células T CD8 + y anticuerpos anti-HIV en los animales estudiados. Resultados semejantes fueron obtenidos cuando se fusionó el dominio AC de la toxina a epítopes de Plasmodium falciparium. Esta tecnología también se empleó en la fusión de epítopes de Mycobacterium tuberculosis al dominio catalítico de TAC, y como respuesta se estimuló la producción de IFN-γ por linfocitos T en pacientes enfermos con tuberculosis(TB), lo cual podría facilitar la detección de infecciones latentes en muestras de sangre de individuos infectados con TB e incluso en individuos infectados con HIV. El uso como una herramienta para la detección de proteínas intracelulares y en estudios de interacción proteína-proteína La toxina adenilato ciclasa es usada como herramienta en diversas investigaciones de Biología Celular. Por ejemplo, como reportero selectivo para la identificación de proteínas bacterianas secretadas por el sistema de secreción tipo III. Estas bacterias por lo general son patógenas de plantas y animales e insertan directamente sus toxinas en el citoplasma de células eucariota. Este mecanismo de secreción ha sido identificado en: Salmonella spp, Yersinia spp, Xanthomonas spp, Shigella spp, en Escherichia coli enteropatogénica y Pseudomonas aeruginosa. El sistema reportero consiste en fusionar la proteína acerca de la cual se quiere conocer el mecanismo de secreción al dominio catalítico de TAC mediante ingeniería genética. De modo que cuando la fusión es introducida en el citoplasma de las células eucariota por la bacteria el dominio catalítico se une a CaM e inmediatamente cataliza la síntesis de grandes cantidades de AMPc. La CyaA, también se ha empleado en el desarrollo de ensayos colorimétricos que permiten determinar la viabilidad celular mediante el sistema de secreción tipo III. La estructura modular del dominio AC de TAC se compone de dos fragmentos complementarios. Esta característica brinda la posibilidad de estudiar las interacciones proteína-proteína en mutantes de E. coli que no expresan adenilato ciclasa (E. coli-AC) mediante la fusión por separado de dichos fragmentos a la proteína en estudio. La actividad adenilato ciclasa se encuentra asociada a la complementación de los fragmentos y la síntesis de AMPc, De este modo, es posible detectarla fenotípicamente en mutantes de E. coli-AC, que pasan a ser (E. coli-AC). 27 Por otra parte; la toxina ha sido empleada, con resultados alentadores en la caracterización de proteínas de E. coli, involucradas en la división celular, y en la detección de codones de parada en genes prematuros. Uso como un posible componente de las vacunas acelulares antipertúsicas A pesar de que la toxina adenilato ciclasa constituye uno de los principales factores de virulencia para B. pertussis, esta no ha sido incluida como un componente en vacunas acelulares de nueva generación. En ratones inmunizados con la toxina purificada se ha visto cierto grado de protección contra B. pertussis, debido a que los anticuerpos antiCyaA neutralizan a la toxina y por tanto estimulan la fagocitosis de la bacteria mediada por los neutrófilos. Se ha reportado la posibilidad de incluir a la toxina como un nuevo componente de las vacunas contra el agente causal de la tosferina, ya que la inmunización con CyaA inactivada, en combinación con otros componentes de las vacunas acelulares, protege significativamente contra B. pertussis. Sin embargo, se encontró como un efecto no deseado, que la toxina bloquea temporalmente a los receptores CR3 e inhibe la fagocitosis dependiente del complemento por neutrófilos, por lo que, la posibilidad de su inclusión como un componentes en las vacunas acelulares se esta estudiando. CONCLUSIONES La toxina adenilato ciclasa – hemolisina de Bordetella pertussis, constituye uno de sus principales factores de virulencia. La estructura flexible de la toxina la convierten en una importante herramienta para la industria biofarmacéutica y la investigación. A pesar de la elevada respuesta humoral y celular inducida por la forma inactivada de la toxina en modelos animales, su inclusión como un componente adicional en las vacunas acelulares contra B. pertussis continúa en discusión. Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 44, No.3, pp. 46-56, 2013. 53 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Gentilea,A. Infección por Bordetella pertussis. Arch Argent Pediatr 2010;108:78-78. 2. Cotter A, Miller JF. Bordetella. In E.A. Groisman (ed.), Principles of bacterial pathogenesis. Academic Press, Ltd., London, United Kindom; 2001. p. 619-674. 3. Celso Pérez-Bolaños, Lourdes Proenza-Alonso, Rafael Fando-Calzada.La vacunación contra pertussis: Estado actual y perspectivas futuras. Revista CENIC Ciencias Biológicas 2012; 43: 29-36. 4. Dotres C, Vega D, Toraño G, Álvarez M, Broche A. Síndrome coqueluchoide y tos ferina. Revista Cubana de Medicina General Integral 2012; 28: 725-734. 5. Murphy TV, Slade BA, Broder KR, Kretsinger K, Tiwari T, Joyce PM, et al. 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